凝膠色譜填料發(fā)展簡(jiǎn)史 – 背后的產(chǎn)業(yè)發(fā)展啟示
2025-5-17 11:16:24點(diǎn)擊：
最近在梳理色譜填料知識(shí)庫(kù)，特別是凝膠填料的部分，捎帶深入了解了下其發(fā)展歷史。一直好奇這個(gè)領(lǐng)域的產(chǎn)品為什么是瑞典人做的比較好，背后的原因是什么？好了，索性一桿子戳到底，這次把它徹底弄個(gè)明白，以史為鑒，為將來(lái)技術(shù)和產(chǎn)品的開發(fā)做一些指導(dǎo)。
寫科技史、產(chǎn)品史和公司史需要結(jié)合不同的歷史背景、人物和時(shí)間線來(lái)組合，缺一不可。本著說(shuō)清楚，搞明白的精神，我們帶著幾個(gè)問(wèn)題來(lái)的，結(jié)合問(wèn)題來(lái)找答案（內(nèi)容都是有出處的），根據(jù)答案結(jié)合筆者的認(rèn)知和理解找啟示。
1.天降奇才
回答這個(gè)問(wèn)題，需要把目光投回到1926年，這年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)?lì)C給了瑞典人-Theodor Svedberg (特奧多爾·斯韋德貝里)，作為瑞典人要拿諾貝爾獎(jiǎng)，個(gè)人認(rèn)為其實(shí)潛在比其他國(guó)家要難些，主要是為了體現(xiàn)權(quán)威性和公平公正，你頒獎(jiǎng)給自己國(guó)家的人其實(shí)會(huì)有些顧慮，得服眾。這位可是個(gè)傳奇人物，富二代，少年不學(xué)無(wú)術(shù)，結(jié)果有一天被中學(xué)校長(zhǎng)一頓臭罵，忽然開竅，從此開掛，發(fā)奮讀書，1904年優(yōu)異成績(jī)進(jìn)烏普薩拉大學(xué)，1905年就獲學(xué)士學(xué)位，1907年就獲得博士學(xué)位，開始留校當(dāng)講師。（注： 烏普薩拉：Uppsala,瑞典城市，位于首都斯德哥爾摩北邊不遠(yuǎn)，有著名的烏普薩拉大學(xué)，同時(shí)也是目前全球最重要的色譜凝膠填料供應(yīng)商Cytiva（思拓凡）的生產(chǎn)基地，前身為GE Healthcare, 再前為Amersham Bioscience，再再前為Pharmacia）
那時(shí)候物理化學(xué)研究得一個(gè)熱點(diǎn)是膠體化學(xué)，他為了更好研究膠體，于1924年研制了超速離心機(jī)(Ultracentrifuge)， 這東西在當(dāng)時(shí)對(duì)于大分子和膠體可以說(shuō)是打開了局面，起到了很大的推動(dòng)作用，人們可以用這種離心機(jī)來(lái)分離純化各種大分子和膠體了。所以1926年就拿了諾貝爾獎(jiǎng)。
特奧多爾·斯韋德貝里 The (Theodor) Svedberg - 獲獎(jiǎng)?wù)?| 諾貝爾獎(jiǎng)訊
Theodor Svedberg (特奧多爾·斯韋德貝里)1926年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)獲得者。
好了，故事有了開始，天降牛人，落戶烏普薩拉大學(xué)。可是，這只是關(guān)于膠體和大分子的分離，跟色譜凝膠有啥關(guān)系，別急，第二位大神馬上閃亮登場(chǎng)。
Theodor Svedberg教授拿了諾獎(jiǎng)，這下就吸引瑞典各方優(yōu)秀學(xué)子來(lái)從師優(yōu)勢(shì)資源匯集。 1925年，一位來(lái)自瑞典港口城市哥德堡的青年學(xué)子Arne Tiselius（阿爾內(nèi)·蒂塞利烏斯）開始跟著Svedberg教授讀博士。那么就讓這位年輕人研究研究帶電的膠體顆粒吧，沒想到這位就真在這個(gè)方向開拓出了一個(gè)新的領(lǐng)域，創(chuàng)立了電泳技術(shù)，成為開山鼻祖。所謂電泳，就是帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，向著與其電性相反的電極移動(dòng)，那么就可以利用帶電粒子在電場(chǎng)中的移動(dòng)速度不同，使物質(zhì)分離，這就是電泳技術(shù)。他還利用根據(jù)這個(gè)原理設(shè)計(jì)制造的移動(dòng)界面電泳儀成功分離了三種血清白蛋白，從而可以深入研究其復(fù)雜性質(zhì)，從而使人們對(duì)血清蛋白的認(rèn)知有了巨大進(jìn)步。1930年拿到博士學(xué)位，1938年拿到烏普薩拉大學(xué)教授位置，同時(shí)在物理化學(xué)系外，創(chuàng)建了生物化學(xué)系。1948年，Arne Tiselius因?qū)﹄娪粳F(xiàn)象和吸附分析的研究，特別是對(duì)血清蛋白復(fù)雜性質(zhì)的研究而獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。
好，到這里慢慢接近了，電泳和色譜都屬于分離科學(xué)的范疇了。
Black and white photo of Arne Tiselius
Arne Tiselius（阿爾內(nèi)·蒂塞利烏斯）1948年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)獲得者
好了，到這里，故事的發(fā)展基本上是兩個(gè)大牛打基礎(chǔ)的節(jié)奏，Svedberg和Tiselius共同在烏普薩拉大學(xué)營(yíng)造了獨(dú)特的學(xué)術(shù)環(huán)境，后來(lái)被稱為"烏普薩拉分離科學(xué)學(xué)派" （Uppsala School in Separation Science），吸引了無(wú)數(shù)富有創(chuàng)新精神的年輕科學(xué)家前來(lái)朝圣。2. 意外的發(fā)現(xiàn)– 天時(shí)、地利、人和
1939年 二戰(zhàn)爆發(fā)，瑞典在整個(gè)二戰(zhàn)期間保持中立，但整個(gè)世界都在打戰(zhàn)，物資匱乏，得想辦法搞資源啊。瑞典人民喜歡往主食面包加上果醬，一開戰(zhàn)，這個(gè)東西就匱乏了。于是瑞典糖業(yè)公司（Sockerbolaget）就找到了烏普薩拉大學(xué)的Tiselius教授，您這不是搞生物化學(xué)的大牛嗎，咱們這里甜菜很多，能榨出蔗糖來(lái)，能不能從里面再搞點(diǎn)別的東西出來(lái)，比如果膠替代品（戰(zhàn)爭(zhēng)期間柑橘果膠短缺）。
甜菜
好，這里第三位重磅人物Bj?rn Ingelman（比約恩·英格爾曼）閃亮登場(chǎng)。
Bj?rn Ingelman（比約恩·英格爾曼）
1941年，23歲的Ingelman慕名加入了Tiselius教授的團(tuán)隊(duì)，成為研究助手。接到的任務(wù)就是從甜菜中提取果膠以替代戰(zhàn)時(shí)短缺的柑橘果膠。無(wú)巧不成書，夏天的時(shí)候，瑞典糖業(yè)公司給Ingelman寄來(lái)很多甜菜樣本，他發(fā)現(xiàn)這些甜菜老是黏黏的，而且提取的果膠質(zhì)量總是不達(dá)標(biāo)。所以說(shuō)科學(xué)發(fā)現(xiàn)就是那么巧，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，樣本是因?yàn)榧?xì)菌污染形成黏性物質(zhì)。 再進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，確定其為腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）代謝蔗糖產(chǎn)生的葡聚糖(Dextran)這種高分子量葡萄糖聚合物并非原研究目標(biāo)，但I(xiàn)ngelman敏銳地意識(shí)到其潛在價(jià)值。這時(shí)候正值二戰(zhàn)熱火朝天的時(shí)候，血漿奇缺，這種天然高分子量的親水性物質(zhì)剛好可以用來(lái)替代血漿中的蛋白來(lái)保持滲透壓。 于是Ingelman與生理學(xué)家Anders Gr?nwall合作，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)（如兔子注射）發(fā)現(xiàn)葡聚糖不會(huì)引發(fā)抗體反應(yīng)，且具有與血漿相似的生理特性。所以說(shuō)有敏銳商業(yè)頭腦的科學(xué)家是科技型企業(yè)成功的關(guān)鍵，這一偶然發(fā)現(xiàn)似乎與凝膠填料技術(shù)相距甚遠(yuǎn)，卻成為其誕生的物質(zhì)基礎(chǔ)。
想法有了，那么接下來(lái)怎么生產(chǎn)和推廣呢，畢竟這邊只是個(gè)大學(xué)的研發(fā)機(jī)構(gòu)，真正的商業(yè)化還需要專業(yè)的才行。這時(shí)候關(guān)鍵的公司Pharmacia（法瑪西亞）出場(chǎng)了。
Pharmacia公司的歷史可以追溯到1911年，由藥劑師Gustav Felix Gr?nstedt在瑞典斯德哥爾摩創(chuàng)立，和大多數(shù)歐美大藥企的發(fā)家史類似，早期主要是靠賣“神藥”起家的。Pharmacia的起家產(chǎn)品是Phospho-Energon，類似瑞典的神奇藥物“腦白金”， 作為神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素和治療疲勞和神經(jīng)衰弱的靈丹妙藥銷售。該藥物主要由小牛腦、糖和牛奶制成，以粉末和片劑形式出售。Phospho-Energon多年來(lái)一直是其最賺錢的產(chǎn)品，好的地方就是出售的利潤(rùn)使該公司后來(lái)能夠投資原創(chuàng)藥物。
1920-1950的Pharmacia工廠
Pharmacia早期產(chǎn)品Phospho-Energon
幸運(yùn)的是，1943年 Bj?rn Ingelman 和 Anders Gr?nwall 聯(lián)系了Pharmacia的時(shí)候，工程師背景出生的時(shí)任總經(jīng)理Elis G?th對(duì)這個(gè)想法非常感興趣，予以大力支持。四年后，Pharmacia 根據(jù)這一發(fā)現(xiàn)推出了 Macrodex （6%葡聚糖溶液）產(chǎn)品。這也是 Pharmacia 與烏普薩拉大學(xué)生物化學(xué)系之間長(zhǎng)期合作的開始。這款藥物也被視為瑞典的第一款生物技術(shù)藥物。
Elis G?th
Macrodex的西班牙語(yǔ)宣傳頁(yè)
嘗到和大學(xué)合作的甜頭，Pharmacia公司一發(fā)不可收拾，Elis G?th做了一個(gè)非常大膽的決定，在1950年把整個(gè)公司搬到了烏普薩拉大學(xué)旁邊，同時(shí)把剛拿到博士學(xué)位的Bj?rn Ingelman招入公司當(dāng)研發(fā)總監(jiān)，全面負(fù)責(zé)葡聚糖系列產(chǎn)品的開發(fā)。學(xué)術(shù)與產(chǎn)業(yè)的這種無(wú)縫銜接在當(dāng)時(shí)的歐洲并不多見，卻是瑞典科學(xué)界的特色——科學(xué)家不滿足于發(fā)表論文，而是積極尋求解決實(shí)際問(wèn)題的途徑；企業(yè)也不短視于眼前利益，愿意投資基礎(chǔ)研究的長(zhǎng)期發(fā)展。3.又一次的意外
前面說(shuō)過(guò)瑞典糖業(yè)公司要的是果膠，所以Ingelman在意外發(fā)現(xiàn)葡聚糖（dextran）。為了提高dextran的成膠性，采用環(huán)氧氯丙烷進(jìn)行交聯(lián)，得到了一種不溶于水，但在水中溶脹的凝膠。但瑞典糖業(yè)公司對(duì)這種水不溶性凝膠不是特別感興趣，因此Ingelma沒有申請(qǐng)專利，但他多留個(gè)心眼，也沒有公開發(fā)表相關(guān)的內(nèi)容。把這種交聯(lián)過(guò)的凝膠一直保留著。
接下來(lái)的重要人物， Ingelman的兩位師弟Jerker Porath和Per Flodin要登場(chǎng)了。 Porath和Flodin于1950年代初加入Tiselius教授的研究團(tuán)隊(duì)，這兩個(gè)年青人被安排從事利用填充柱電泳分離生物大分子，兩人迅速成為好友，時(shí)常一起探討科學(xué)問(wèn)題。一起尋找合適的可以用來(lái)裝柱進(jìn)行分離的吸附劑(adsorbent)。 最初嘗試用淀粉和纖維素等材料填充色譜柱，但由于吸附作用較大，效果不佳。
Flodin進(jìn)到Pharmacia后做的一項(xiàng)研究工作，就是重復(fù)再現(xiàn)和確認(rèn)前面提到的Ingelman用環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)葡聚糖的工作，由于有之前淀粉和纖維素等材料填充色譜柱進(jìn)行分離的經(jīng)驗(yàn)，F(xiàn)lodin馬上意識(shí)到這東西值得一試。由于他和Porath還保持聯(lián)系，經(jīng)常討論科學(xué)問(wèn)題，而此時(shí)Porath仍在苦苦尋找合適的適合用于電泳柱分離的惰性（吸附作用小）的填充劑，兩人一拍即合，再次合作。由于葡聚糖的吸附作用非常小，Porath在填充交聯(lián)葡聚糖的色譜柱實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)分子按大小分離的現(xiàn)象——大分子比小分子更快通過(guò)色譜柱，且無(wú)需電場(chǎng)（不同于電泳）。實(shí)驗(yàn)證實(shí)該凝膠能高效分離蛋白質(zhì)，而且葡聚糖凝膠還可以實(shí)現(xiàn)對(duì)孔徑的控制。兩人立刻意識(shí)到這個(gè)發(fā)現(xiàn)的重要性，于是一頭Porath在大學(xué)實(shí)驗(yàn)室里繼續(xù)做各種實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證，而另一頭，F(xiàn)lodin在1957年在Pharmacia內(nèi)部提交了開發(fā)葡聚糖凝膠用于生物分子分離的項(xiàng)目申請(qǐng)，雖然和Pharmacia做藥物開發(fā)的主業(yè)不符合，但研發(fā)總監(jiān)Bj?rn Ingelman慧眼識(shí)珠，力排眾議，大力支持。于是項(xiàng)目立項(xiàng)，有錢有人了，Pharmacia公司這邊負(fù)責(zé)凝膠的制備，而烏普薩拉大學(xué)那邊負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)和肽的分離實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)進(jìn)展順利，1958年申請(qǐng)了兩個(gè)專利，一個(gè)關(guān)于凝膠制備，一個(gè)關(guān)于關(guān)于凝膠過(guò)濾。Porath和Flodin將這一方法命名為“凝膠過(guò)濾”（Gel Filtration），也就是現(xiàn)在的尺寸排阻色譜（Size Exclusion Chromatography, SEC）。 Pharmacia也準(zhǔn)備好了正式推出交聯(lián)的葡聚糖產(chǎn)品，名字就是現(xiàn)在還在銷售的Sephadex 分別取了Separation, Pharmacia, Dextran這三個(gè)單詞的開頭字母, 后續(xù)的一系列產(chǎn)品線命名基本都遵循這個(gè)原則。
1959年：Porath和Flodin在《Nature》發(fā)表開創(chuàng)性論文《Gel filtration: A method for desalting and group separation》，描述葡聚糖色譜凝膠填料快速、簡(jiǎn)單的分離特性。 同時(shí)，Pharmacia公司也在文章發(fā)表的同時(shí)，在北美市場(chǎng)正式推出了Sephadex產(chǎn)品，大受歡迎，上市的備貨兩周就被搶空，因?yàn)楫a(chǎn)品太搶手，整個(gè)第一年的產(chǎn)品都是直接空運(yùn)去美國(guó)。層析凝膠填料橫空出世，分離科學(xué)再次有了重大突破性進(jìn)展。
Sephadex填料是如何誕生的？
早期Sephadex產(chǎn)品
從Sephadex層析凝膠填料誕生的歷史回顧，我們可以發(fā)現(xiàn)幾個(gè)關(guān)鍵的節(jié)點(diǎn)，人物，事件以及背后的邏輯關(guān)聯(lián)。
1. 天降大牛需珍惜
基因的突變每個(gè)人都有，突變的方向和結(jié)果，是拼概率事件，這樣才能最大化保持種群的多樣性，提高極端情況下的生存概率。在穩(wěn)定發(fā)展環(huán)境中要出個(gè)天才的概率是低的，所以要特別珍惜。像本文中一開始奠定基礎(chǔ)的Theodor Svedberg正是一個(gè)極好的例子，天才和大牛往往在每個(gè)階段或很長(zhǎng)事件在常人看來(lái)是“怪怪”的，比如Theodor Svedberg一開始的“不學(xué)無(wú)術(shù)”，所以需要社會(huì)有足夠的寬容性，才能形成孕育天才和大牛的溫床。
2. 給錢，給人，給資源
有了牛人，要快速形成資源的聚集效應(yīng)，給錢，給人，給資源，這樣可以快速吸引眾多優(yōu)秀人才的聚集效應(yīng)，筑巢引鳳，思想碰撞后產(chǎn)生好的idea的概率會(huì)大幅提高，更容易出成果。但這也是把雙刃劍，資源過(guò)于集中，容易形成學(xué)閥，學(xué)霸，形成小團(tuán)體，反而不好。Theodor Svedberg引來(lái)Arne Tiselius, Arne Tiselius又吸引來(lái)他的一系列弟子，才能促成Sephadex的誕生，這可能也和那時(shí)候瑞典人骨子里的北歐海盜精神相關(guān)，更著重群體的民主和利益分配。
當(dāng)下時(shí)代，牛人自帶流量光環(huán)的話，錢，人，資源會(huì)自動(dòng)聚集，形成馬太效應(yīng)，新型產(chǎn)業(yè)的起始發(fā)展到規(guī)模效應(yīng)的時(shí)間會(huì)更短，迭代也會(huì)更快速。
3. 學(xué)術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界的合作
老生常談的問(wèn)題了。 個(gè)人認(rèn)為處于學(xué)術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界中的連接點(diǎn)和關(guān)鍵人物至關(guān)重要，如本例中的Bj?rn Ingelman，具備敏銳商業(yè)嗅覺，同時(shí)又是學(xué)術(shù)界出身的背景。同時(shí)學(xué)術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界的相向而行也非常重要，學(xué)術(shù)界需要?jiǎng)?chuàng)新，不走尋常路，不能被產(chǎn)業(yè)界現(xiàn)有的技術(shù)路線和模式牽著鼻子走，但是在探出一條新路的起始階段，對(duì)其后續(xù)發(fā)展的路徑，所需資源，商業(yè)模式等需要積極引入產(chǎn)業(yè)界資源來(lái)合理做研判，提前規(guī)劃好專利布局，利益和資源分配，時(shí)機(jī)成熟的要早上快上，搶占戰(zhàn)略高地，對(duì)于時(shí)機(jī)尚未成熟的，要做到心中清楚需要等待哪些資源和技術(shù)路線到位，做有心人。產(chǎn)業(yè)界對(duì)于新的發(fā)現(xiàn)和路線，要有更多的開發(fā)心態(tài)，切合主業(yè)的路線如何引入，資源如何分配，對(duì)和目前主業(yè)不切合的新型技術(shù)，是體外孵化，是找合作方共同推進(jìn)，還是對(duì)外license out，需要有逐步建立規(guī)范的操作體系流程。
自1959年 Sephadex 葡聚糖凝膠發(fā)明后，極大推動(dòng)了色譜凝膠填料的發(fā)展，后續(xù)這個(gè)領(lǐng)域橫向發(fā)展出不同交聯(lián)分子量的葡聚糖，瓊脂糖，交聯(lián)瓊脂糖，高流速瓊脂糖等一系列不同填料基質(zhì)，縱向上發(fā)展出除起始的尺寸排阻色譜（SEC）填料外的離子交換色譜（Ion-Exchange Chromatograhy, IEC）填料,親和層析（Affinity Chromatography, AC）填料, 疏水作用層析(Hydrophobic Interaction Chromatography, HIC)和多模式（Multi-mode Chromatography MMC）等一系列結(jié)合不同配基的填料系列。
說(shuō)到了1959年P(guān)harmacia公司正式發(fā)布Sephadex 葡聚糖凝膠產(chǎn)品，Sephadex填料生在一個(gè)好“時(shí)代”， 1960-90年代正是分子生物學(xué)大爆發(fā)的時(shí)代， 核酸，蛋白，酶、激素和其他生物大分子，各種研究的熱點(diǎn)，給了凝膠色譜填料最好的舞臺(tái)。Pharmacia也從一家瑞典本土藥企進(jìn)化成全球知名的分子生物學(xué)產(chǎn)品公司。但是葡聚糖凝膠填料也有其“先天”的缺陷，Sephadex由交聯(lián)的葡聚糖構(gòu)成，富含羥基，具有極強(qiáng)的親水性。這對(duì)于生物相容性而言是好事，但是其三維網(wǎng)絡(luò)在低離子強(qiáng)度溶液中吸水膨脹，但在高離子強(qiáng)度時(shí)因外部溶液的滲透壓增加，導(dǎo)致凝膠脫水收縮。這一過(guò)程類似于普通水凝膠的溶脹/收縮行為。
葡聚糖Dextran化學(xué)結(jié)構(gòu)式
這種情況在Sephadex被改性為離子交換樹脂（如DEAE-Sephadex、CM-Sephadex）后，帶電荷基團(tuán)進(jìn)一步引入。更加嚴(yán)重。
在低離子強(qiáng)度下：
·離子交換基團(tuán)去質(zhì)子化/質(zhì)子化（如DEAE的氨基帶電）；
·基團(tuán)間的靜電排斥力增強(qiáng)，導(dǎo)致凝膠網(wǎng)絡(luò)擴(kuò)張，加劇吸水膨脹；
·分子內(nèi)排斥使得交聯(lián)結(jié)構(gòu)松散，孔隙增大。
在高離子強(qiáng)度時(shí)：
·溶液中的反離子（如Na?、Cl?）屏蔽了固定電荷間的靜電排斥；
·凝膠網(wǎng)絡(luò)收縮，孔隙縮小；
基于葡聚糖dextran凝膠填料在不同離子強(qiáng)度下的體積“縮放”，同時(shí)交聯(lián)度較低，難以耐受較大壓力和高流速的缺點(diǎn)，在工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)的時(shí)候就成了瓶頸了，所以從Sephadex凝膠填料剛一推出后，人們就開始積極尋找替代的基材。
4.聚丙烯酰胺凝膠
到這里，不出意外，色譜凝膠填料發(fā)展史上的另一位重磅人物要登場(chǎng)了，中國(guó)色譜界如雷貫耳的烏普薩拉大學(xué)的Stellan Hjertén教授。Stellan Hjertén對(duì)于層析填料和毛細(xì)管電泳技術(shù)發(fā)展都做出了巨大的貢獻(xiàn)，可以說(shuō)是分析化學(xué)里好幾個(gè)方向的開山鼻祖。這里只重點(diǎn)講和色譜凝膠填料相關(guān)的部分。
Stellan Hjertén
Stellan Hjertén本來(lái)在烏普薩拉大學(xué)本科和碩士主攻物理學(xué)，結(jié)果被上集介紹過(guò)的1948年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)獲得人 Arne Tiselius教授慧眼識(shí)珠，收入門下做了關(guān)門弟子。而Stellan Hjertén愿意加入的原因是他觀察到烏普薩拉大學(xué)生物化學(xué)系中最成功的博士生往往是那些在物理化學(xué)或物理學(xué)方面有良好背景的人。 如同很多武俠小說(shuō)的情節(jié)，師父收的關(guān)門小師弟都是比較能“折騰”的。Stellan Hjertén屬于開掛選手，第一個(gè)研究項(xiàng)目就發(fā)現(xiàn)了羥基磷灰石填料。剛好在開發(fā)羥基磷灰石填料用于色譜分離檢測(cè)的時(shí)候，他的兩位師兄Jerker Porath and Per Flodin給各位師弟們分配了任務(wù)，試試用交聯(lián)的葡聚糖凝膠進(jìn)行電泳測(cè)試實(shí)驗(yàn)。而Hjertén觀察到分析物根據(jù)大小發(fā)生了分離。并把實(shí)驗(yàn)結(jié)果展示給Porath。從那時(shí)起，葡聚糖凝膠就僅由Porath和Flodin進(jìn)行研究，并且只研究它們的色譜特性，結(jié)果就是上集里說(shuō)到的Sephadex的上市。Hjertén的名字沒出現(xiàn)在申請(qǐng)的專利和發(fā)表的文章上，有點(diǎn)遺憾。但是塞翁失馬，焉知非福，由于不能再對(duì)葡聚糖凝膠進(jìn)行研究，反而讓Hjertén轉(zhuǎn)向研究非葡聚糖類凝膠的研究，開拓一片新天地，不對(duì)，確切說(shuō)是好幾片新天地。由于Hjertén正好在用聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分子篩， 因此順理成章地試試這些凝膠用于色譜分子篩。不試不要緊，一試嚇一跳，非常大的蛋白質(zhì)也可以通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠過(guò)濾進(jìn)行分離，效果非常好。
Bio-Rad Laboratories（伯樂(lè)）公司一開始是個(gè)夫妻店起家，David and Alice Schwartz夫婦都是加州伯克利大學(xué)的，畢業(yè)后開了這家公司，一開始主要提供生物分子的標(biāo)記，那時(shí)候標(biāo)記可主要用的放射性核素標(biāo)記哦，所以Bio-Rad的 Biochemical-Radiochemical的縮寫結(jié)合，看來(lái)那個(gè)時(shí)候公司和產(chǎn)品取名都好這口。
Schwartz夫婦和Bio-Rad早期團(tuán)隊(duì)
David Schwartz一直和Tiselius保持著良好的私人關(guān)系，密切關(guān)注著這個(gè)研究組的科研進(jìn)展，這時(shí)候既然Pharmacia公司不感興趣，Bio-Rad公司迅速介入，連帶著之前的羥基磷灰石填料，加上聚丙烯酰胺分離介質(zhì)，好東西統(tǒng)統(tǒng)都要。基于Hjertén發(fā)現(xiàn)的聚丙烯酰胺介質(zhì)和后續(xù)開發(fā)大規(guī)模制備聚丙烯酰胺填料微球的技術(shù)，Bio-Rad公司在1964年推出了Bio-Gel? P 色譜凝膠填料 （P=polyacrylamide），從而在分析科學(xué)市場(chǎng)，特別是蛋白質(zhì)分離市場(chǎng)一炮而紅，成了Pharmacia公司的主要競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手之一。此后，Pharmacia Fine Chemicals （1967 年從Pharmacia里單獨(dú)成立，專門針對(duì)非藥物產(chǎn)品市場(chǎng)）（生產(chǎn)葡聚糖凝膠， Sephadex）和Bio-Rad（生產(chǎn)聚丙烯酰胺凝膠，Bio-Gel? P）之間的競(jìng)爭(zhēng)極大促進(jìn)了這些填料的持續(xù)改進(jìn)。
Bio-Rad的Bio-Gel? P
有意思的是，后來(lái)Pharmacia公司認(rèn)識(shí)到此類產(chǎn)品的重要性，推出了通過(guò)丙烯基葡聚糖與N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺共聚形成的復(fù)合凝膠產(chǎn)品，商標(biāo)為Sephacryl。
早期Sephacryl S系列產(chǎn)品宣傳材料
科研中的積極心態(tài)
目前各種國(guó)產(chǎn)化替代的過(guò)程，基本是有已知的明確參照物，體系和參數(shù)指標(biāo)的，但后續(xù)進(jìn)入深水區(qū)，“無(wú)人區(qū)”，需要開拓新方向和新目標(biāo)的時(shí)候，沒有參照物了，這個(gè)時(shí)候積極的心態(tài)非常重要，Hjertén教授在回憶錄里有句名言“如果我也參與了Dextran凝膠（Sephadex?）的開發(fā)，聚丙烯酰胺凝膠（和瓊脂糖凝膠）可能永遠(yuǎn)不會(huì)被用于分子篩（這無(wú)疑會(huì)阻礙生命科學(xué)的發(fā)展）。這只是我在研究中，以及在一般生活中經(jīng)驗(yàn)性發(fā)現(xiàn)的一個(gè)“規(guī)則”：一個(gè)在開始時(shí)看似消極的實(shí)驗(yàn)或事件，從長(zhǎng)遠(yuǎn)來(lái)看，當(dāng)從正確的角度看待它時(shí)，結(jié)合其他實(shí)驗(yàn)和事件，可能會(huì)帶來(lái)積極的結(jié)果。”
英文里有個(gè)專門詞匯對(duì)應(yīng)這類現(xiàn)象：Serendipity ，類似中文里的“無(wú)心插柳柳成蔭”。我們后續(xù)需要引領(lǐng)科技發(fā)展前沿的話，可能還需要多一些這樣的“運(yùn)氣”和孕育這樣運(yùn)氣的環(huán)境。
初創(chuàng)公司的突破
1950-60年代，美國(guó)出現(xiàn)了一批初創(chuàng)公司，采用一種快速、高效的商業(yè)化實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)品的模式，Bio-Rad公司就是采用這種打法，利用聚丙烯酰胺色譜凝膠填料一戰(zhàn)成名，讓Pharmacia這個(gè)歐洲傳統(tǒng)藥企公司有點(diǎn)措手不及，所以后續(xù)Pharmacia把非藥產(chǎn)品剝離出來(lái)，單獨(dú)成了Pharmacia Fine Chemicals公司來(lái)應(yīng)對(duì)，這才催生了后續(xù)更強(qiáng)大的凝膠色譜填料系列產(chǎn)品。
接下來(lái)是最重磅的瓊脂糖凝膠填料登場(chǎng)，故事更加精彩。
葡聚糖和聚丙烯酰胺色譜凝膠填料的發(fā)現(xiàn)和產(chǎn)品上市，但是這兩個(gè)系列填料有幾個(gè)先天不足的缺點(diǎn)。
1.機(jī)械強(qiáng)度不夠，無(wú)法上高壓力，這就意味無(wú)法提供高流速，大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用上受限。
2.填料內(nèi)部孔徑還不夠大， 無(wú)法分離大分子量蛋白質(zhì)或生物體，如病毒或核糖體。
3.葡聚糖填料在緩沖液的離子強(qiáng)度變化時(shí)會(huì)膨脹或收縮。
4.聚丙烯酰胺的單體丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，同時(shí)也是致癌物質(zhì)
隨著1959年葡聚糖凝膠在色譜分離的應(yīng)用的文章發(fā)表后，人們開始在各種類似葡聚糖結(jié)構(gòu)的糖類里淘寶，由于前面介紹的Tiselius教授的研究小組也在尋找一種與自由區(qū)帶電泳實(shí)驗(yàn)相似的介質(zhì)，即無(wú)分子篩效應(yīng)的凝膠，有人報(bào)道過(guò)使用瓊脂（Agar）作為凝膠來(lái)跑電泳，但由于存在帶電基團(tuán)，效果并不怎么好。（具體瓊脂和瓊脂糖的區(qū)別及它們的前世今生，也是非常有趣的故事，后續(xù)值得來(lái)個(gè)番外篇）。
但是前面介紹的大牛Hjerten教授卻沒輕易放棄，他研究了許多關(guān)于瓊脂化學(xué)結(jié)構(gòu)的文章后，了解到一位日本研究人員Choji Araki（荒山朝次）早在1937年就發(fā)現(xiàn)瓊脂由兩種多糖組成：一種帶電的，他稱之為瓊脂糖醛酸，和一種不帶電的，瓊脂糖。（目前的定義：瓊脂是一種與硫酸酯、丙酮酸和甲基基團(tuán)不同程度取代的多糖混合物，而瓊脂糖就是其中具有最低電荷含量的部分）。（其實(shí)日本人是最早研究瓊脂和瓊脂糖結(jié)構(gòu)，結(jié)果分別被德國(guó)人和瑞典人分別截胡，做成了微生物學(xué)和分子生物學(xué)的兩門大生意）。
瓊脂糖Agarose的化學(xué)結(jié)構(gòu)式
瓊脂糖是由瓊脂二糖(agarobiose)重復(fù)單元組成的線性聚合物，瓊脂二糖是由 D-半乳糖（D-galactose）和3,6-脫水-L-吡喃半乳糖（3,6-anhydro-L-galactopyranose）組成的二糖。n大約是350-400 （瓊脂糖的平均分子量約為120,000）。了解到瓊脂和瓊脂糖的不同，一下子就打開了局面，那就從瓊脂里面來(lái)提取瓊脂糖，從定義來(lái)說(shuō)也比較直接，就是去掉瓊脂里帶電的部分，留下不帶電或帶電極少的部分。科學(xué)家開發(fā)了不少方法來(lái)干這個(gè)，如下表。
從瓊脂中提取瓊脂糖的方法列表
獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)造就了瓊脂糖獨(dú)特的性質(zhì)
1.3,6-脫水-L-半乳糖殘基中的分子內(nèi)醚鍵（C3與C6之間的鍵）（上圖中紅色虛線圈）是凝膠化的關(guān)鍵，促進(jìn)雙螺旋結(jié)構(gòu)的形成。
2.瓊脂糖雙螺旋通過(guò)另一組氫鍵聚集成三維網(wǎng)絡(luò)纖維，圍繞大量水分形成相互連接的孔隙。由于結(jié)構(gòu)靠氫鍵支撐，所以對(duì)于高溫和高鹽還是會(huì)破壞瓊脂糖凝膠的結(jié)構(gòu)圖片。瓊脂糖可逆凝膠化過(guò)程：從隨機(jī)線圈形成雙螺旋（三級(jí)結(jié)構(gòu)）并最終形成大網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。
4% 瓊脂糖凝膠掃描電子顯微鏡照片
3.凝膠溫度(Gelling temperature)和熔融溫度(Melting Temperature)的滯后(Hystersis)現(xiàn)象, 及凝膠溫度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于熔融溫度，使得瓊脂糖凝膠在常溫下始終保持凝膠狀態(tài)，只有加熱到很高的溫度才會(huì)熔融，極大地?cái)U(kuò)展了應(yīng)用便利性。4.瓊脂糖鏈上的羥基賦予其強(qiáng)親水性，使其對(duì)蛋白質(zhì)等生物分子吸附極低，適合生物分離。
5.瓊脂糖凝膠的孔徑隨濃度增加而減小，適合大分子分離。
6.瓊脂糖的羥基可通過(guò)溴化氰、環(huán)氧氯丙烷等活化，偶聯(lián)配基，實(shí)現(xiàn)不同的功能化。
7.瓊脂糖凝膠僅靠氫鍵所以機(jī)械強(qiáng)度低。通過(guò)化學(xué)交聯(lián)可穩(wěn)定螺旋結(jié)構(gòu)，提高耐壓性和耐極端pH能力。交聯(lián)不改變孔徑，但顯著提升剛性。
8.瓊脂糖相較于它的原材料瓊脂而言殘留的硫酸根和丙酮酸基團(tuán)極少，將電內(nèi)滲（electroendosmosis，EEO）的影響降至最低，所以也非常適合對(duì)帶電的生物大分子的電泳分離，常見的實(shí)驗(yàn)室跑膠，多指的就是采用瓊脂糖凝膠電泳分離帶負(fù)電的核酸分子。
9.瓊脂糖的結(jié)構(gòu)對(duì)酶解和水解都具有比較好的抵抗力
不同濃度瓊脂糖微球填料（未交聯(lián)+交聯(lián)）對(duì)比聚丙烯酰胺填料的分離分子量范圍
有了這些獨(dú)特的優(yōu)良性質(zhì)，加上之前開發(fā)聚丙烯酰胺填料的經(jīng)驗(yàn)，。Hjerten先是開發(fā)了簡(jiǎn)化的大規(guī)模瓊脂糖制備技術(shù)（1961-1962年），解決了早期瓊脂因帶電基團(tuán)導(dǎo)致的吸附和電內(nèi)滲問(wèn)題，然后就依葫蘆畫瓢，于1964年首次報(bào)道了制備瓊脂糖微球用于色譜分離。 
這次Pharmacia公司不會(huì)再錯(cuò)過(guò)了， 馬上合作，并于1967年推出了商業(yè)化銷售的瓊脂糖色譜凝膠微球產(chǎn)品，商品名為Sepharose（Separation, Pharmacia, Agarose）。如上面總結(jié)的瓊脂糖的獨(dú)特化學(xué)性質(zhì)，難以找到具有相同或更好的色譜性能的替代品于是它們?cè)趯?shí)驗(yàn)室和工業(yè)生產(chǎn)上廣受歡迎。Sepharose和基于瓊脂糖微球的系列產(chǎn)品迅速成為Pharmacia公司利潤(rùn)最高的色譜填料產(chǎn)品—直到今天仍然是。從Sepharose推出之后，圍繞瓊脂糖微球填料的進(jìn)一步改進(jìn)和功能化就在不斷進(jìn)行。主要是以下幾個(gè)方面：
1.交聯(lián)技術(shù)的改進(jìn)
l 早期交聯(lián)：Porath等人（1971年）引入二溴丙醇和雙環(huán)氧化合物交聯(lián)，提高了機(jī)械穩(wěn)定性，基于此，Pharmacia在1975年推出了形成Sepharose CL系列產(chǎn)品 （CL=Cross-Link, 交聯(lián)）
l 鹽存在下交聯(lián)：Laurent和Axelsson發(fā)現(xiàn)高濃度鹽可收縮瓊脂糖纖維，促進(jìn)交聯(lián)劑滲透，開發(fā)出Sepharose Fast Flow系列（1985年），耐壓性顯著提升，為工業(yè)規(guī)模的應(yīng)用鋪平了道路。
l 組合交聯(lián)劑：Pharmacia公司（1982年）采用短鏈（環(huán)氧基）和長(zhǎng)鏈（碳鏈）雙交聯(lián)劑組合，推出Superose系列，孔徑分布更優(yōu)
l 預(yù)交聯(lián)技術(shù)：在瓊脂糖溶液中加入含活性/非活性基團(tuán)的雙功能交聯(lián)劑（如烯丙基縮水甘油醚），凝膠化后激活非活性基團(tuán)，實(shí)現(xiàn)高效交聯(lián)，用于Capto系列
Sepharose系列產(chǎn)品時(shí)間表
針對(duì)瓊脂糖凝膠微球交聯(lián)技術(shù)不斷優(yōu)化，就是保持孔隙和比表面積特點(diǎn)的同時(shí)，不斷提高耐壓性，同時(shí)對(duì)極端pH及有機(jī)溶劑有一定耐受性，并且可以高壓滅菌，再加上Pharmacia公司于1982年推出的Fast protein liquid chromatography (FPLC)硬件系統(tǒng)的配合，一下子打通從實(shí)驗(yàn)室到工廠的全系列應(yīng)用鏈條。這部分基本就是今天的AKTA系列的前身。
早期的FPLC儀器設(shè)備
AKTA Avant 儀器設(shè)備
2.羥基活化瓊脂糖結(jié)構(gòu)中有大量的羥基可以作為活化的位點(diǎn)，除了做交聯(lián)外，也可以在活化后結(jié)合其他的功能基團(tuán)，從而徹底打開瓊脂凝膠填料應(yīng)用的天花板。相當(dāng)于利用交聯(lián)的瓊脂糖作為基礎(chǔ)骨架，在上面可以接出不同功能的配基來(lái)實(shí)現(xiàn)基于不同模式（如電荷-離子交換，親和，疏水，多模式等）的分離。
瓊脂糖微球羥基活化主要有以下幾種：
溴化氰（CNBr）活化：1967年由Axen等首次引入多糖材料活化，但存在異脲鍵不穩(wěn)定、配基易脫落的問(wèn)題。同時(shí)溴化氰有毒性。
環(huán)氧氯丙烷活化：作為CNBr的替代方案，因其低毒性和高活化率被廣泛應(yīng)用，但受限于其在水中的溶解度。
烯丙基縮水甘油醚活化：一端環(huán)氧基與瓊脂糖羥基反應(yīng)，另一端惰性雙鍵減少副反應(yīng)，同時(shí)后續(xù)可以進(jìn)一步活化雙鍵，根據(jù)需求上不同配基，大大提高了反應(yīng)的可控性和靈活性。
NHS活化：對(duì)伯胺基配基偶聯(lián)速度快、效率高且酰胺鍵在堿性條件下下穩(wěn)定。
二乙烯基砜（DVS）：用于羥基載體活化，偶聯(lián)氨基、巰基等，但堿性條件下不穩(wěn)定。
還原氨化法：通過(guò)NaIO4氧化生成醛基，與伯胺形成希夫堿后還原為穩(wěn)定仲胺鍵，但后續(xù)容易有美拉德副反應(yīng)，微球易變黃。
上述方法中加深的部分為現(xiàn)在比較主流應(yīng)用的瓊脂糖凝膠微球活化方法
3.配基修飾
羥基活化好了，接下來(lái)就結(jié)合不同的應(yīng)用和分離模式來(lái)上結(jié)合不同的配基。
- 離子交換-Ion Exchanger (IEX)
陰離子交換（Anion Exchanger, AEX）
弱陰離子交換就用DEAE
陽(yáng)離子交換 (Cation Exchanger, CEX)
這個(gè)一般都用磺酸基團(tuán)，Sulfonate group, 所以商品名帶 S
- 疏水作用（Hydrophobic Interaction Chromatography, HIC）
比如Butyl- =結(jié)合丁基 Phenyl- =結(jié)合苯環(huán)，Octyl-=結(jié)合辛基，疏水性依次增強(qiáng)
- 多模式作用（Multi-Mode Chromatography, MMC）
紅框的羧基提供負(fù)電荷，藍(lán)框的苯基提供疏水作用，綠框的羰基可以作為氫鍵的受體，而黃框的氨基則可以作為氫鍵的供體。
- 親和作用 (Affinity Chromatography, AC)
Protein A是1958年在金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus細(xì)胞壁上發(fā)現(xiàn)的一種蛋白，分子量約為42 kDa，包含從N端到C端的五個(gè)同源結(jié)構(gòu)域：E、D、A、B和C （每個(gè)結(jié)構(gòu)域有58個(gè)氨基酸殘基），每個(gè)結(jié)合域都能與多種哺乳類動(dòng)物的免疫球蛋白結(jié)合，最主要為IgG。Protein A能與大多數(shù)免疫球蛋白重鏈的Fc區(qū)域結(jié)合，當(dāng)Protein A與免疫球蛋白結(jié)合后，這些免疫球蛋白便失去了作用，進(jìn)而摧毀免疫系統(tǒng)的吞噬作用及調(diào)理作用。這也就是金黃色葡萄球菌致病的厲害之處，驚不驚喜，意不意外，好的科學(xué)發(fā)現(xiàn)就是從大自然里學(xué)習(xí)，變廢為寶，化害為利。更有意思的是，早期的Protein A的純化，采用的就是我們之前提到的Sephadex色譜填料。
Protein A一經(jīng)發(fā)現(xiàn)，馬上就引起了搞凝膠色譜填料的科學(xué)家的關(guān)注，這不就是夢(mèng)寐以求的親和配基嗎，剛好那段時(shí)間，Porath的團(tuán)隊(duì)投入了大量精力在研究如何在Sephadex凝膠微球上引入不同的蛋白和酶，1966年人們剛發(fā)現(xiàn)Protein A與IgG的特異性作用后，馬上就利用現(xiàn)成的活化后引入配基的技術(shù)，把天然Protein A接到了瓊脂糖微球上，形成了第一代的親和瓊脂糖色譜填料。短短一年左右，團(tuán)隊(duì)在Nature上前后發(fā)表了三篇相關(guān)文章，多么美好的時(shí)代。也充分說(shuō)了在凝膠色譜填料固定化結(jié)合酶和各種生物活性分子的重要性和對(duì)后來(lái)分子生物學(xué)發(fā)展的推動(dòng)作用。
A) 蛋白A基因序列：信號(hào)序列（S）、五個(gè)IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域（D、E、A、B和C）和細(xì)胞壁結(jié)合區(qū)（XM），B) IgG的Fc區(qū)與蛋白A的B結(jié)構(gòu)域之間的相互作用示意圖。
Protein A凝膠親和填料的發(fā)展史基本就是一部重組蛋白工程化史，工程化努力都集中在提高更高的結(jié)合載量、延長(zhǎng)填料使用壽命、提高穩(wěn)定性，以增強(qiáng)其在暴露于嚴(yán)苛條件（如和洗脫步驟中的酸性pH和原位清洗（CIP）的堿性pH）的耐受性。我們還是以（Pharmacia-Amersham-GE Healthcare-Cytiva）的protein A瓊脂糖填料系列的發(fā)展史為例來(lái)講。
GE Healthcare公司的Protein A瓊脂糖填料演化史圖
最開始比較簡(jiǎn)單直接，就是從天然蛋白A結(jié)構(gòu)中去除不必要的部分，去掉信號(hào)序列S，去掉細(xì)胞壁結(jié)合區(qū)XM，效果不錯(cuò)，這種做減少了天然Protein A的非IgG Fc結(jié)合區(qū)域與蛋白質(zhì)的非特異性結(jié)合， 提高了洗脫的單抗的純度，同時(shí)采用大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)，也避免了動(dòng)物源污染風(fēng)險(xiǎn)。據(jù)此1996年推出了rProtein A Sepharose FF，其重組Protein A包含五個(gè)串聯(lián)結(jié)構(gòu)域：E、D、A、B、C。盡管去除了非結(jié)合域，僅保留五個(gè)結(jié)構(gòu)域，但每個(gè)域均可與IgG的Fc段結(jié)合，且結(jié)合強(qiáng)度略有差異，導(dǎo)致洗脫條件不一致，常需要低pH值。劇烈的洗脫條件易使單抗變性、形成聚集體或復(fù)性困難，對(duì)敏感型單抗不利。
那么如果減少串聯(lián)結(jié)構(gòu)域的個(gè)數(shù)，并且采取同型結(jié)構(gòu)域串聯(lián)，應(yīng)該有幫助，于是MabSelect產(chǎn)品于2001年誕生了，采用了B結(jié)構(gòu)域的四聚體形式的重組Protein A，同時(shí)在C 端導(dǎo)入半胱氨酸，通過(guò)硫醚鍵與環(huán)氧基團(tuán)活化的瓊脂糖微球定向偶聯(lián)，在提高結(jié)合載量的同時(shí)，也消除了不同結(jié)構(gòu)域與抗體Fc 段親和性的差異，使得洗脫條件更溫和而均一。（注意：Pharmacia公司在1997年和英國(guó)的Amersham 合并成立了Amersham Pharmacia Biotech，這個(gè)產(chǎn)品一炮而紅，讓合并后的公司從以實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)品為主趁著單抗藥物發(fā)展的東風(fēng)，一把殺進(jìn)了工業(yè)規(guī)模，Amersham的財(cái)報(bào)年年必提MabSelect.）
但是CIP過(guò)程中的耐堿性怎么辦呢，總不能清洗幾個(gè)循環(huán)就不能用了，不耐堿的活，脫落的Protein A配基對(duì)于藥物安全性也是個(gè)大問(wèn)題。那接著對(duì)Protein A工程化改造吧， 這個(gè)時(shí)候，科學(xué)家對(duì)于B結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列已經(jīng)理解比較深入了，首先人工造出了個(gè)B 結(jié)構(gòu)域的功能類似物和能量最小化版本，稱為Z結(jié)構(gòu)域，同時(shí)替換了天冬酰胺殘基（對(duì)堿最敏感的氨基酸，使蛋白質(zhì)容易脫酰胺），創(chuàng)建了一個(gè)z結(jié)構(gòu)域四聚體配體， 同時(shí)包含一個(gè) C 端半胱氨酸，通過(guò)硫醚鍵和環(huán)氧化物間隔臂與高交聯(lián)的瓊脂糖微球進(jìn)行定向偶聯(lián)。這樣在2005年誕生了經(jīng)典的MabSelect Sure耐堿型的Protein A填料。 具有非常低的配體脫落，同時(shí)選擇性定向提供了更高的結(jié)合載量。
后續(xù)的MabSelect PrismA將配基Z結(jié)構(gòu)域四聚體提高為六聚體，從而進(jìn)一步提高了單抗結(jié)合載量和耐堿性。
最新的Protein A凝膠填料為MabSelect PrismA X和MabSelect SuRe 70 應(yīng)該也是在結(jié)合載量和耐堿性上進(jìn)行提高和改進(jìn)。比如瓊脂糖粒徑變小點(diǎn)，這樣可以在相同體積下，增加更多的表面積來(lái)增加配基密度，從而實(shí)現(xiàn)更大的結(jié)合載量。或者通過(guò)延長(zhǎng)柱內(nèi)的停留時(shí)間來(lái)提高結(jié)合載量。
從瓊脂糖凝膠色譜填料的發(fā)展歷史，可以預(yù)見
1.瓊脂糖因?yàn)槠洫?dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)導(dǎo)致的獨(dú)特性質(zhì)使其在目前各類凝膠中脫穎而出，成為最主流和工業(yè)規(guī)模應(yīng)用最多的凝膠層析填料基材，后續(xù)的進(jìn)一步的發(fā)展和突破需要有更優(yōu)異性能的基材，在保持親水性，生物相容性，可修飾性的基礎(chǔ)上，在孔隙率，連通率和機(jī)械性能上實(shí)現(xiàn)更好好的平衡點(diǎn)。 現(xiàn)有的聚合物類的填料已經(jīng)形成了沖擊之勢(shì)，但還需要進(jìn)一步解決親水性和生物相容性的問(wèn)題。
2.固定化和偶聯(lián)化學(xué)的方法已經(jīng)相對(duì)比較成熟，后續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵在于配基。特別針對(duì)親和色譜，好的配基是決定成敗的關(guān)鍵。由于瓊脂糖本身的化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的限制，同時(shí)考慮到配基與分離目標(biāo)分子作用的空間位阻效應(yīng)，最終的配基密度會(huì)有一個(gè)天花板。
3.新型的瓊脂糖微球制備工藝，比如膜乳化造球，噴射造球，微流控通道造球等，會(huì)對(duì)傳統(tǒng)的水/油相乳化法形成挑戰(zhàn)和沖擊。
4.非色譜柱類分離方法的挑戰(zhàn)，因?yàn)樗幬锷a(chǎn)的保守性，以及打破已有的工藝體系，重建新的工藝路線和體系的成本考量，在沒有體現(xiàn)出較大的性能和/或經(jīng)濟(jì)效益之前，還需要時(shí)日，畢竟凝膠色譜填料發(fā)現(xiàn)，上市，從實(shí)驗(yàn)室規(guī)模到大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用規(guī)模，是從上世紀(jì)50年代一直持續(xù)到現(xiàn)在，已經(jīng)接近80年的時(shí)間，需要好幾代人持續(xù)不斷的工作。
生物工藝產(chǎn)品，特別是凝膠色譜填料國(guó)產(chǎn)化替代之后的科技引領(lǐng)，新技術(shù)，新產(chǎn)品，新體系的打造該怎么做，希望本系列的內(nèi)容能帶來(lái)一些思考和啟示！
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